Aptima® HPV assay

Aptima HPV assay

Určené použití

Test APTIMA HPV je amplifikační test cílové sondy nukleové kyseliny pro in vitro kvalitativní detekci E6/E7 virové messengerové RNA (mRNA) z 14 vysoce rizikových typů HPV (16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/66/68). Test APTIMA HPV nerozlišuje mezi 14 vysoce rizikovými typy. Cervikální klinické vzorky pro Pap test odebrané do zkumavek ThinPrep obsahujících roztok PreservCyt lze analyzovat pomocí testu APTIMA HPV před zpracováním Pap i po něm, což platí i pro cervikální vzorky odebrané pomocí odběrové a přepravní soupravy APTIMA. Tento test lze použít k testování vzorků buď systémem přímého odběru do zkumavek (Direct Tube Sampling – DTS) nebo systémem TIGRIS DTS. Kromě toho lze test použít v systému PANTHER k testování cervikálních vzorků odebraných pomocí soupravy APTIMA pro odběr a přepravu vzorků.

Principy metody

Test APTIMA HPV zahrnuje tři hlavní kroky, které se provádí v jedné zkumavce: zachycení cíle a jeho amplifikace pomocí transkripčně zprostředkované amplifikace (Transcription- Mediated Amplification – TMA), a poté detekce produktů amplifikace (amplikonu) pomocí testu hybridizační ochrany (Hybridization Protection Assay – HPA). Test zahrnuje vnitřní kontrolu, která monitoruje zachycení nukleové kyseliny, amplifikaci a detekci, a rovněž chyby operátora nebo přístroje. Klinické vzorky se odebírají nebo jsou přenášeny ve zkumavce obsahující roztok, který lýzuje buňky, uvolňuje mRNA a chrání ji před rozkladem v průběhu uchovávání. Když se provádí test APTIMA HPV, cílová mRNA je z vzorku izolována pomocí záchytných oligomerů, které se navazují na magnetické mikročástice. Záchytné oligomery obsahují sekvence, které jsou komplementární ke specifickým oblastem HPV mRNA cílových molekul, a také řetězec deoxyadenosinových zbytků. Během hybridizačního kroku se sekvenčně specifické oblasti záchytných oligomerů váží na specifické oblasti cílové molekuly HPV mRNA. Komplex záchytného oligomeru a cíle je poté vychytáván z roztoku snížením teploty reakce na pokojovou teplotu. Toto snížení teploty umožňuje hybridizaci mezi deoxyadenosinovou oblastí na záchytném oligomeru a polydeoxythimidinovými molekulami, které jsou kovalentně připojeny k magnetickým částicím. Mikročástice, včetně zachycených cílových molekul HPV mRNA, které jsou na ně navázané, jsou zataženy ke straně reakční zkumavky pomocí magnetů a supernatant se odsaje. Částice se promyjí, aby se odstranila reziduální matrice vzorku, která může obsahovat inhibitory amplifikace. Po dokončení zachycení cíle je HPV mRNA amplifikována pomocí TMA, což je metoda amplifikace nukleové kyseliny založená na transkripci, která využívá dva enzymy, reverzní transkriptázu MMLV a polymerázu T7 RNA. Reverzní transkriptáza se používá k vytvoření kopie DNA sekvence cílové mRNA obsahující sekvenci promotéru pro polymerázu T7 RNA. Polymeráza T7 RNA produkuje více kopií RNA amplikonu z kopie DNA templátu. Detekce amplikonu je dosaženo metodou HPA využívající jednořetězcové sondy nukleové kyseliny s chemiluminiscenčním označením, které jsou komplementární k amplikonu. Značené sondy nukleové kyseliny hybridizují specificky s amplikonem. Selekční reagencie rozlišuje hybridizovanou od nehybridizované sondy deaktivací značení nehybridizované sondy. Během detekčního kroku je světlo vyzařované z označených hybridů RNA:DNA měřeno jako fotonové signály v luminometru a intenzita je hlášena jako relativní světelné jednotky (RLU). Ke každé reakci se přidává vnitřní kontrola prostřednictvím reagencie pro zachycení cíle. Vnitřní kontrola monitoruje zachycení cíle, amplifikaci a detekční kroky testu. Signál vnitřní kontroly je při každé reakci odlišen od signálu HPV podle odlišné kinetiky světla emitovaného ze sond s různým označením. Amplikon specifický pro vnitřní kontrolu je detekován sondou s rychlou emisí světla (blikající). Amplikon specifický pro HPV je detekován pomocí sond s relativně pomalejší kinetikou emise světla (žhavicí). Dvojitý kinetický test (Dual Kinetic Assay – DKA) je metodou používanou k rozlišení blikajících a žhavicích signálů.

Související produkty: